液相色譜儀保留時(shí)間漂移原因排查周寧, <p class="ql-block">“保留時(shí)間是液相色譜定性分析的核心依據(jù)，其穩(wěn)定性直接決定了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。實(shí)際操作中，保留時(shí)間漂移（組分保留時(shí)間持續(xù)提前/延后、無(wú)規(guī)律波動(dòng)）是高頻問(wèn)題，可能導(dǎo)致定性錯(cuò)誤、定量失真。其原因可歸納整理為色譜柱、流動(dòng)相、樣品、儀器硬件四大類?！?lt;/p> <p class="ql-block" style="text-align:center;"><b style="font-size:20px; color:rgb(57, 181, 74);"><i>色譜柱原因</i></b></p><p class="ql-block"> 色譜柱是實(shí)現(xiàn)樣品分離的核心部件，其性能狀態(tài)與保留時(shí)間直接相關(guān)，約30%的保留時(shí)間漂移問(wèn)題源于色譜柱本身的異常。</p><p class="ql-block"> 固定相流失反相色譜中最常用的C18、C8等硅膠基質(zhì)色譜柱，當(dāng)流動(dòng)相pH值超出2-8的最佳范圍時(shí)，硅膠基質(zhì)會(huì)發(fā)生水解，導(dǎo)致鍵合相（如十八烷基硅烷）脫落，固定相總量減少。</p><p class="ql-block">隨著使用次數(shù)增加，固定相對(duì)目標(biāo)組分的保留能力逐漸下降，表現(xiàn)為保留時(shí)間持續(xù)縮短。</p><p class="ql-block">例如，分析堿性化合物時(shí)若使用高pH（>8.5）流動(dòng)相，未進(jìn)行封端處理的普通C18柱可能在數(shù)十次進(jìn)樣后出現(xiàn)明顯保留時(shí)間漂移，同時(shí)伴隨柱效下降（峰寬變寬）。</p><p class="ql-block"> 正相色譜柱的固定相（如硅膠、氨基鍵合相）則易受流動(dòng)相中水分影響，水分會(huì)占據(jù)固定相活性位點(diǎn)，降低其對(duì)極性組分的保留能力，導(dǎo)致保留時(shí)間逐漸縮短。</p><p class="ql-block">此外，高溫（超過(guò)40℃）會(huì)加速固定相流失速率，尤其在梯度洗脫中，高比例強(qiáng)洗脫溶劑會(huì)加劇鍵合相脫落。</p><p class="ql-block"> 色譜柱污染樣品中的雜質(zhì)、流動(dòng)相中的污染物或未完全溶解的組分，會(huì)在色譜柱柱頭富集形成“污染層”。</p><p class="ql-block">相當(dāng)于在原有固定相基礎(chǔ)上增加了新的“次級(jí)固定相”，改變了實(shí)際分離環(huán)境。</p><p class="ql-block">輕度污染表現(xiàn)為保留時(shí)間緩慢漂移，重度污染則伴隨壓力升高、峰型拖尾。</p><p class="ql-block">例如，分析食品基質(zhì)中的農(nóng)藥殘留時(shí)，若樣品前處理不徹底，油脂、色素會(huì)附著在柱頭，導(dǎo)致目標(biāo)組分保留時(shí)間逐針延長(zhǎng)。</p><p class="ql-block">色譜柱柱頭塌陷色譜柱填充不均勻或受到劇烈壓力波動(dòng)時(shí)，會(huì)發(fā)生柱頭塌陷，導(dǎo)致流動(dòng)相流速分布不均，組分在柱內(nèi)的遷移路徑改變，保留時(shí)間隨之波動(dòng)。</p><p class="ql-block">這種漂移通常伴隨基線噪聲增大和峰型畸變（如前延峰）。</p><p class="ql-block"> 色譜柱未充分平衡新色譜柱啟用前未進(jìn)行活化，或每次更換流動(dòng)相后平衡時(shí)間不足，是最易被忽視的漂移原因。</p><p class="ql-block"> 新柱內(nèi)通常填充甲醇或乙腈，與實(shí)際分析用流動(dòng)相存在洗脫強(qiáng)度差異，需通過(guò)持續(xù)沖洗使固定相與流動(dòng)相達(dá)到熱力學(xué)平衡。</p><p class="ql-block" style="text-align:center;"> 梯度洗脫后，若未用初始比例流動(dòng)相充分平衡（通常需10-20個(gè)柱體積），柱內(nèi)殘留的強(qiáng)洗脫溶劑會(huì)導(dǎo)致后續(xù)進(jìn)樣的保留時(shí)間偏短，且逐針逐漸恢復(fù)正常。</p> <p class="ql-block" style="text-align:center;"><b style="color:rgb(57, 181, 74); font-size:20px;"><i><u>流動(dòng)相原因</u></i></b></p><p class="ql-block"> 流動(dòng)相的組成、性質(zhì)及穩(wěn)定性直接決定洗脫強(qiáng)度，其微小變化都可能引發(fā)保留時(shí)間顯著漂移，這一因素占漂移問(wèn)題的40%以上。</p><p class="ql-block"> 流動(dòng)相組成比例偏差手動(dòng)配制流動(dòng)相時(shí)，溶劑體積量取誤差（如1000mL流動(dòng)相中西腈比例偏差1%）會(huì)直接改變洗脫強(qiáng)度。</p><p class="ql-block">反相色譜中，強(qiáng)洗脫溶劑（如乙腈）比例每增加1%，組分保留時(shí)間可縮短10%-15%。</p><p class="ql-block"> 即使是二元高壓梯度系統(tǒng)，也可能因比例閥磨損、單向閥泄漏導(dǎo)致溶劑混合比例不準(zhǔn)確。</p><p class="ql-block">例如比例閥響應(yīng)延遲會(huì)使梯度洗脫中實(shí)際有機(jī)相比例低于設(shè)定值，導(dǎo)致保留時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。</p><p class="ql-block">溶劑純度不足劣質(zhì)甲醇中可能含有微量乙醇或水分，這些雜質(zhì)會(huì)改變流動(dòng)相的極性；</p><p class="ql-block"> 緩沖鹽試劑純度低時(shí)，含有的雜質(zhì)離子會(huì)影響流動(dòng)相離子強(qiáng)度，尤其在離子對(duì)色譜中，離子對(duì)試劑濃度的微小變化會(huì)顯著改變保留行為。</p><p class="ql-block">流動(dòng)相pH值波動(dòng)對(duì)于可解離的酸性或堿性組分，流動(dòng)相pH值是影響保留時(shí)間的關(guān)鍵因素。</p><p class="ql-block">當(dāng)pH值變化接近組分的pKa值（±1范圍內(nèi)）時(shí)，組分的解離度會(huì)發(fā)生劇烈變化，導(dǎo)致保留能力顯著改變。</p><p class="ql-block">例如，分析苯甲酸（pKa≈4.2）時(shí)，流動(dòng)相pH從4.0升至5.0，苯甲酸解離度增加，與反相柱固定相的疏水作用減弱，保留時(shí)間可縮短50%以上。</p><p class="ql-block">pH值波動(dòng)的主要原因：</p><p class="ql-block">?? 緩沖鹽配制時(shí)pH調(diào)節(jié)不準(zhǔn)確；</p><p class="ql-block">?? 緩沖體系緩沖容量不足（如低濃度乙酸鹽緩沖液）；</p><p class="ql-block">?? 流動(dòng)相放置過(guò)程中吸收空氣中CO?（導(dǎo)致pH降低）或揮發(fā)（導(dǎo)致pH升高）；</p><p class="ql-block">?? 不同品牌的緩沖鹽試劑純度差異。</p><p class="ql-block">流行想溫度與揮發(fā)性變化溫度會(huì)影響流動(dòng)相的黏度和密度，進(jìn)而改變其洗脫強(qiáng)度。</p><p class="ql-block">柱溫箱溫控不準(zhǔn)確時(shí)，流動(dòng)相溫度波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間漂移：</p><p class="ql-block">溫度每升高1℃，反相色譜中組分保留時(shí)間通?？s短1%-3%。</p><p class="ql-block"> 即使柱溫箱正常，若流動(dòng)相未與柱溫箱達(dá)到溫度平衡，室溫波動(dòng)（如晝夜溫差、空調(diào)直吹）也會(huì)引發(fā)保留時(shí)間變化。</p><p class="ql-block">具有揮發(fā)性的流動(dòng)相（如甲醇-水、乙腈-水體系）在放置過(guò)程中，有機(jī)相易揮發(fā)導(dǎo)致比例改變。</p><p class="ql-block">尤其在敞口溶劑瓶中，室溫下乙腈每日揮發(fā)量可達(dá)1%-2%，導(dǎo)致流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度下降，保留時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。</p><p class="ql-block" style="text-align:center;">此外，流動(dòng)相脫氣不徹底時(shí)，氣泡進(jìn)入色譜柱會(huì)造成局部流速波動(dòng)，表現(xiàn)為保留時(shí)間不規(guī)則漂移。</p> <p class="ql-block" style="text-align:center;"><b style="font-size:20px; color:rgb(57, 181, 74);"><i>樣品原因</i></b></p><p class="ql-block"> 樣品本身的性質(zhì)及前處理質(zhì)量，可能通過(guò)影響分離系統(tǒng)狀態(tài)間接導(dǎo)致保留時(shí)間漂移，這一因素常被誤判為儀器或流動(dòng)相問(wèn)題。</p><p class="ql-block"> 樣品基質(zhì)干擾與污染復(fù)雜基質(zhì)樣品（如血清、土壤提取液）中含有的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、色素等雜質(zhì)，會(huì)與色譜柱固定相結(jié)合，形成不可逆吸附。</p><p class="ql-block"> 這些雜質(zhì)不僅會(huì)占據(jù)固定相活性位點(diǎn)，還可能改變固定相表面性質(zhì)。</p><p class="ql-block">例如蛋白質(zhì)在C18柱上吸附后，會(huì)使固定相疏水性降低，導(dǎo)致目標(biāo)組分保留時(shí)間縮短。</p><p class="ql-block">這種漂移通常具有累積性，隨進(jìn)樣次數(shù)增加愈發(fā)明顯。</p><p class="ql-block"> 若樣品中含有與固定相親和力極強(qiáng)的組分，即使含量極低，也會(huì)緩慢占據(jù)固定相位點(diǎn)，形成“記憶效應(yīng)”。</p><p class="ql-block">例如分析含長(zhǎng)鏈烷基化合物的樣品后，若未充分沖洗色譜柱，殘留的長(zhǎng)鏈組分可能導(dǎo)致后續(xù)分析中極性組分保留時(shí)間延長(zhǎng)。</p><p class="ql-block"> 樣品溶解性與溶劑效應(yīng)樣品溶劑與流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度差異過(guò)大時(shí)，會(huì)產(chǎn)生“溶劑效應(yīng)”，導(dǎo)致保留時(shí)間不穩(wěn)定。</p><p class="ql-block">例如，用純乙腈溶解樣品，而流動(dòng)相為乙腈-水（20:80），進(jìn)樣后樣品溶液在柱頭與流動(dòng)相混合，局部洗脫強(qiáng)度驟增，目標(biāo)組分保留時(shí)間縮短，且峰型易前延。</p><p class="ql-block"> 若樣品溶解性差，未完全溶解的微小顆粒會(huì)堵塞色譜柱柱頭，導(dǎo)致柱壓升高和保留時(shí)間漂移。</p><p class="ql-block">此外，樣品溶液的pH值與流動(dòng)相差異過(guò)大，會(huì)改變柱頭區(qū)域流動(dòng)相的局部pH值，影響可解離組分的保留行為。</p><p class="ql-block" style="text-align:center;">例如，堿性樣品用中性溶劑溶解，注入流動(dòng)相為酸性的系統(tǒng)中，柱頭局部pH升高，可能導(dǎo)致組分保留時(shí)間一次性偏移后趨于穩(wěn)定。</p> <p class="ql-block" style="text-align:center;"><b style="font-size:20px; color:rgb(57, 181, 74);"><i>儀器硬件原因</i></b></p><p class="ql-block"> 儀器核心硬件模塊的性能異常，會(huì)直接破壞分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致保留時(shí)間漂移，這類問(wèn)題約占15%。</p><p class="ql-block"> 輸液系統(tǒng)故障輸液系統(tǒng)是維持流動(dòng)相穩(wěn)定輸送的關(guān)鍵，其故障會(huì)直接導(dǎo)致流量波動(dòng)。</p><p class="ql-block">單向閥磨損或污染是最常見原因：閥芯被雜質(zhì)堵塞或密封圈老化后，會(huì)出現(xiàn)“單向閥內(nèi)漏”，導(dǎo)致實(shí)際輸出流量低于設(shè)定值。</p><p class="ql-block">流量每降低0.1mL/min（以1.0mL/min為設(shè)定值），反相色譜中組分保留時(shí)間可延長(zhǎng)10%左右。</p><p class="ql-block"> 高壓泵密封墊老化、泵頭有氣泡或梯度混合器故障，也會(huì)導(dǎo)致流量不穩(wěn)定。</p><p class="ql-block">例如，泵密封墊磨損會(huì)造成壓力波動(dòng)，壓力變化超過(guò)5%時(shí)，保留時(shí)間通常會(huì)出現(xiàn)明顯漂移；</p><p class="ql-block"> 進(jìn)樣系統(tǒng)異常進(jìn)樣閥閥芯磨損或定量環(huán)污染，可能導(dǎo)致進(jìn)樣量不準(zhǔn)確，但通常不直接引發(fā)保留時(shí)間漂移。</p><p class="ql-block"> 然而，若進(jìn)樣閥密封不嚴(yán)出現(xiàn)泄漏，會(huì)導(dǎo)致樣品在進(jìn)樣過(guò)程中被流動(dòng)相稀釋，或出現(xiàn)“交叉污染”：前一樣品的殘留組分與當(dāng)前樣品共洗脫，可能被誤判為保留時(shí)間漂移。</p><p class="ql-block"> 自動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣針定位不準(zhǔn)或堵塞，會(huì)導(dǎo)致樣品無(wú)法完全進(jìn)入定量環(huán)，雖主要影響峰面積，但進(jìn)樣過(guò)程中引入的氣泡可能干擾流動(dòng)相穩(wěn)定性，間接導(dǎo)致保留時(shí)間波動(dòng)。</p><p class="ql-block"> 柱溫箱與檢測(cè)器問(wèn)題柱溫箱溫控精度不足是常被忽視的硬件因素。</p><p class="ql-block"> 優(yōu)質(zhì)柱溫箱溫控精度應(yīng)在±0.1℃，若溫控偏差超過(guò)±0.5℃，會(huì)通過(guò)改變流動(dòng)相黏度和組分分配系數(shù)影響保留時(shí)間。</p><p class="ql-block">例如，柱溫從30℃升至32℃，反相色譜中弱極性組分保留時(shí)間可能縮短5%以上。</p><p class="ql-block"> 檢測(cè)器本身通常不直接導(dǎo)致保留時(shí)間漂移，但檢測(cè)器流通池堵塞會(huì)造成系統(tǒng)背壓升高，間接影響流動(dòng)相流速；</p><p class="ql-block" style="text-align:center;"> 若檢測(cè)器與色譜柱之間的管路過(guò)長(zhǎng)或內(nèi)徑不均，會(huì)導(dǎo)致組分?jǐn)U散，雖主要影響峰型，但極端情況下可能造成保留時(shí)間輕微偏移。</p> <p class="ql-block" style="text-align:center;"><b style="font-size:20px; color:rgb(57, 181, 74);"><i>保留時(shí)間漂移排查步驟總結(jié)</i></b></p><p class="ql-block"> 保留時(shí)間漂移的排查需遵循“從簡(jiǎn)單到復(fù)雜、從易排查到高成本”的原則，具體步驟如下：</p><p class="ql-block">基礎(chǔ)檢查：確認(rèn)系統(tǒng)平衡狀態(tài)首先觀察基線是否平穩(wěn)，若基線未平，延長(zhǎng)平衡時(shí)間至15-20個(gè)柱體積（新柱或更換流動(dòng)相后需更長(zhǎng)）；</p><p class="ql-block"> 同時(shí)檢查柱溫箱實(shí)際溫度與設(shè)定值是否一致，誤差需控制在±0.2℃內(nèi)。</p><p class="ql-block">這是最快速且成本最低的排查環(huán)節(jié)，可排除80%的基礎(chǔ)問(wèn)題。</p><p class="ql-block"> 流動(dòng)相排除：驗(yàn)證洗脫環(huán)境穩(wěn)定性配制新的流動(dòng)相進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，若漂移消失，說(shuō)明原流動(dòng)相存在比例偏差、pH波動(dòng)或污染；</p><p class="ql-block">若問(wèn)題依舊，檢測(cè)流動(dòng)相pH值（與配制記錄對(duì)比）和脫氣狀態(tài)，觀察溶劑瓶中有機(jī)相是否有明顯揮發(fā)。</p><p class="ql-block"> 色譜柱排查：評(píng)估核心分離部件更換一根同型號(hào)的新色譜柱或已知性能良好的備用柱，若漂移問(wèn)題解決，說(shuō)明原色譜柱存在污染、固定相流失或柱頭塌陷。</p><p class="ql-block"> 可嘗試用強(qiáng)溶劑（如甲醇-乙腈-水=50:50:0）反向沖洗色譜柱進(jìn)行修復(fù)；</p><p class="ql-block">若新柱仍出現(xiàn)漂移，排除色譜柱因素。</p><p class="ql-block"> 樣品排查：消除基質(zhì)與溶劑影響進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品溶液（用流動(dòng)相配制），若保留時(shí)間穩(wěn)定，說(shuō)明問(wèn)題源于樣品基質(zhì)或溶劑效應(yīng)。</p><p class="ql-block">需優(yōu)化樣品前處理方法（如增加凈化步驟）或更換與流動(dòng)相匹配的樣品溶劑；</p><p class="ql-block">若標(biāo)準(zhǔn)品仍漂移，可排除樣品因素。</p><p class="ql-block"> 硬件深度排查：定位系統(tǒng)故障點(diǎn)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)壓力曲線，若壓力波動(dòng)超過(guò)±2%，重點(diǎn)檢查輸液系統(tǒng)：</p><p class="ql-block">拆卸單向閥超聲清洗，更換泵密封墊，排除氣泡干擾；</p><p class="ql-block"> 若壓力穩(wěn)定，檢查進(jìn)樣閥（更換閥芯或清洗定量環(huán)）和柱溫箱溫控模塊（校準(zhǔn)溫度傳感器）；</p><p class="ql-block"> 仍未解決則聯(lián)系廠家檢修高壓泵或梯度混合器。</p><p class="ql-block"> 總之，保留時(shí)間漂移的本質(zhì)是“分離系統(tǒng)熱力學(xué)平衡被破壞”，色譜柱、流動(dòng)相、樣品、儀器硬件四大維度相互關(guān)聯(lián)，排查時(shí)需結(jié)合實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象（如漂移方向、是否伴隨壓力變化、峰型是否異常）精準(zhǔn)定位。</p><p class="ql-block" style="text-align:center;"><span style="color:rgb(255, 138, 0);">日常操作中，規(guī)范色譜柱維護(hù)（定期沖洗、避免極端pH）、嚴(yán)格流動(dòng)相配制流程、優(yōu)化樣品前處理、定期校準(zhǔn)儀器硬件，才是預(yù)防保留時(shí)間漂移的根本措施。</span></p>